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介绍一个常用的实验技术~

【资料图】

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转化烟草，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转化，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

技术背景

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荧光素酶生物检测技术诞生于1990年，已有30年的发展史。单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。

什么是双荧光素酶？

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双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为61 kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36 kDa。

两种荧光素酶的区别是什么？

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①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。

②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：

实验原理

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Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。具体做法是：将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用或miRNA对目的基因或lncRNA的调控作用（见图2）。与此同时，引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以便消除细胞转染等因素带来的组间误差。

Dual Luciferase Reporter实验步骤

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以烟草为材料进行Dual Luciferase Reporter的实验步骤：

1）构建相应的载体。

2）挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到2 mL LB液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃ 220 rpm培养过夜。

3）农杆菌培养至OD600为1.0，1700× g离心5 min收集菌体后，用1/2MS液体培养基清洗菌体2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将农杆菌的OD600调至1.0。

4）将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的OD600为0.5。

5）选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上, 以保证相同的生长背景。

6）正常温室生长条件下，24-48 h即可取样观察。

7）取3-4片直径为6-8 mm的叶盘，放入2 mL的EP管（提前放入3-4个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解叶片。

9）10000-16000 rpm离心1 min，取上清。

10）荧光检测：

①取20 μL裂解液，加至培养板中。按照实验需要，可设置3孔-5孔重复。

②配制萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应液，即萤火虫萤光素酶底物（50 ×）和海肾萤光素酶底物（50×）。

分别用对应的缓冲液稀释至1×工作液。并孵育至室温。

③加入100 μL萤火虫萤光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。

④加入100 μL海肾萤光素酶反应液，震板混匀，检测海肾萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。

荧光素酶报告基因的特点

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1、优越的灵敏度，比Western bloting灵敏度高1000倍以上；

2、内源性低，无内源性表达；

3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；

4、发光检测，检测方便；

5、灵敏度高，1020摩尔荧光素酶分子；

6、检测范围广，大于7个数量级。

主要应用领域

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1、潜在启动子/启动子核心区域检测；

2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测；

3、启动子区可能的转录因子结合位点检测；

4、启动子/增强子与转录因子的相互作用；

5、病毒/细胞相互作用；

6、物理化学等诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）；

参考文献

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2、Sterling, L., M. Walter, D. Ting and B. Schule (2014). "Discovery of functional non-coding conserved regions in the alpha-synuclein gene locus." F1000Res3: 259.

3、Xu, R. X., R. Y. Liu, C. M. Wu, Y. S. Zhao, Y. Li, Y. Q. Yao and Y. H. Xu (2015). "DNA Damage-Induced NF-kappaB Activation in Human Glioblastoma Cells Promotes miR-181b Expression and Cell Proliferation."Cell Physiol Biochem35(3): 913-925.

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